Collage Microbiología

Tinciones

La coloración celular y tejidos son una combinación de fenómenos físicos y químicos de absorción: los fenómenos físicos de absorción, capilaridad y ósmosis participan en cierto grado. La afinidad de colorantes básicos por los tejidos ácidos y viceversa indican que hay reacción quimica

Los Colorantes:

Son compuestos, orgánicos que contienen radicales cromóforos esto es que producen color y grupos de anxocromos que forman sales los grupos nitrito (-NO2) y azo (-N = N) son cromóforos. Los radicales hidroxilo (-OH) y amino (-NH2) son grupos anxocromos. Los cromóforos imparten la propiedad cromógena al colorante y los anxocromos permiten que el colorante se una con la fibra o tejido.

Preparación de Frotis Bacteriano para Coloración:

Entes de la tinción las bacterias suelen encontrarse en agua o en otro líquido en un porta objeto limpio y son extendido en una película uniforme y delgada. Se deja que la película seque en el aire y los microorganismos son fijados por sustancias químicas o por el calor moderado.

Tinciones:

Es un método utilizado para estudiar microorganismos. (no vivos); en estas tinciones se observa morfología, estructura y agrupamientos de microorganismos.

Tipos de Tinción:

Tinción Simple: utiliza un solo colorante.

Tinción de Gram:

Utiliza varios colorantes (cristal violeta 1m, Yodo 1m, lavado con alcohol, Safranina 30 seg)

Tinción Ácido Resistente:

Una vez teñidos, conservan su color resistiendo al lavado con ácido mineral reducido. En esta tinción las bacterias ácido resistentes conservan el colorante primario color rosa o rojo, los demás microorganismos son decolorados por el ácido y toman el color azul.

Tinción de Giensa:

El colorante se aplica a un frotis de sangre y se utiliza cuando se sospeche de protozoos en la sangre para observar materias núcleos de la células.

Tinción de Esporas:

Se usa verde de malaquita en contraste con safranina.

Tinción de Cápsula:

Colorante nigrosuna, aquí se observa microorganismos encapsulados creando resistencias

Tinción de Flagelos:

Se usa mordiente el cual aumenta el tamaño del microorganismo.

Los medios de cultivo en microbiología

Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10.000 medios de cultivo diferentes.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

La mayoría de las bacterias patógenas requieren nutrientes complejos similares en composición a los líquidos orgánicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una infusión de extractos de carne y Peptona a la que se añadirán otros ingredientes.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparación de medios de cultivo. Se licúa completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mínimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en él.

La Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes bacterias provocan su licuación.

En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes.

También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoria de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancia inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar.

Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la preparación de estas sustancias para su aplicación a los medios de cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles.

Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica.

Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado semisólido o sólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla.

Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.

Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

Materiales del laboratorio de Microbiologia

Materiales

Medios de cultivo: Material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los microorganismos, así como efectuar pruebas de susceptibilidad.

Placas de Petri: Platos de plástico de 10 cm de diámetro que se utilizan para cultivo de bacterias

Pipetas pasteur estériles

Bisturíes estériles

Morteros de porcelana o de vidrio estériles

Tubos estériles y tubos de centrífuga

Torundas estériles

Campanas de incubación

Asas de siembra (calibradas o no)

Portaobjetos y cubreobjetos

Hisopos

Asa de Digrasky

Material de vidrio (matraces, vasos de precipitado....)

Bolsas de esterilización

Papel de filtro (para el campo de trabajo)

Espátula /cucharillas

Gradillas

Algodón graso

Guantes de autoclave

Cinta termolábil (para el autoclave, con la cual se comprueba si el autoclave esteriliza bien o no)Pinzas portatubos

Papel de aluminio

Mecheros Bunsen y de alcohol

Cerillas

Aparatos

Cabinas de seguridad: para realizar la siembra de la muestra.

Estufas de cultivo: que permiten incubar los cultivos a diferentes temperaturas

Neveras: guardar los reactivos

Congeladores: guardar los reactivos

Microscopios: ópticos y de fluorescencia

Autoclave: se utiliza para la esterilización de los medios de cultivo, algunos materiales y los cultivos potencialmente peligrosos

Agitador/calefactor

Balanza

Campana de anaerobiosis

Contador de colonias

etc.

Normas de seguridad en el laboratorio de Microbiología.

El acceso al laboratorio de prácticas sólo
se permite a los alumnos que estén
realizando las prácticas. No se admiten
visitas por razones de seguridad.

· Cualquier estudiante que sufra de
alguna deficiencia en sus defensas ante
la infección debe comunicarlo
previamente al profesor.

· Los laboratorios de investigación son de
acceso restringido al personal del
Departamento.

· Es obligatorio utilizar batas abrochadas
siempre que se esté trabajando en el
laboratorio. Durante el periodo de
prácticas, la bata no debe utilizarse
fuera del laboratorio.

· Debe respetarse la prohibición de beber,
comer, masticar chicle o fumar en el
laboratorio y se debe evitar llevarse a la
boca ningún objeto (bolígrafos...) o
tocarse los ojos y nariz.

· En la superficie de trabajo no deben
depositarse en ningún momento ropa u
objetos personales.

· Cada alumno es responsable de la
limpieza de su lugar de trabajo y del
material asignado, así como de los
microscopios que haya usado.

· Está prohibido pipetear con la boca.

· Se deben usar los mecheros Bunsen con
precaución, no dejando material
inflamable cerca y evitando el posible
contacto con pelo y ropas.

· No se pueden utilizar guantes de látex
cuando se trabaja con mechero Bunsen.
· Se comprobará que se ha apagado el
gas al finalizar el experimento y al
abandonar el laboratorio.

· Ante un vertido accidental de material
microbiológico debe informarse
inmediatamente al profesor encargado
del grupo.

· No se debe forzar un tubo de vidrio o la
apertura de un frasco sin tener
protegidas las manos.

· No se manejarán los autoclaves o el
material recién esterilizado si no se
dispone de guantes apropiados.

· La eliminación de residuos, material
desechable y material reciclable se
realizará siguiendo las pautas descritas
en la Guía de Prácticas, utilizando los
contenedores dispuestos a tal efecto.

· Se deben lavar las manos con jabón
antiséptico ante cualquier sospecha de
contaminación y siempre antes de
marcharse del laboratorio.

Bacterias

Las bacterias son organismos de tamaños pequeños pero muy variables. Las bacterias son casi indispensables tanto en nuestra vida diaria como en nuestro mismo organismo, ejemplos de esto es nuestra flora intestinal, en la piel, en la industria ya que ayudan a llevar a cabo varios procesos de investigacion, en los farmacos, tratamientos de aguas residuales, produccion de queso, yogurth y varios productos fermentados, etc.

Pero tanto como bacterias buenas tambien existen malas y nos pueden causar enfermedades como el colera, sifilis etc., si no tenemos el cuidado y la higiene necesarios.

Existen de todo tipo y tamaños y muchas se clasifican por el tipo de energia que usan, por su estructura fisiologica y de cubierta, procariotas y eucariotas, etc.

Las bacterias son los organismos mas abundantes en todo el mundo y estan en casi todos los ecosistemas, el mar, la corteza terrestre, y hasta en las condiciones del espacio exterior.